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Predicción de hígado humano microsomal oxidaciones de 7-etoxicumarina y Clorzoxazona con parámetros cinéticos de recombinantes citocromo P-450 enzimas Abstracto Diferentes funciones de las formas individuales de citocromo humano P-450 (CYP) en la oxidación de 7-etoxicumarina y clorzoxazona se investigaron en microsomas de hígado de diferentes muestras humanas, y las actividades microsomales así obtenidos se predijo con parámetros cinéticos obtenidos de recombinante derivado de cDNA enzimas CYP en microsomas de células de Trichoplusia ni. De las 14 formas de CYP recombinante examinados, CYP1A1 tenía las actividades más altas (V max / m relación K) en la catálisis de 7-etoxicumarina O - deethylation seguido de CYP1A2, 2E1, 2A6, 2B6 y, a pesar de CYP1A1 se ha demostrado que sea una enzima extrahepática . Con estos parámetros cinéticos (con exclusión de CYP1A1), se encontró que la enzima CYP1A2 y 2E1 eran las principales enzimas que catalizan 7-etoxicumarina; las contribuciones de estas dos formas dependían de los contenidos de estos APP en microsomas hepáticos de diferentes seres humanos. Del mismo modo, Clorzoxazona actividades 6-hidroxilación de microsomas de hígado se predijo con parámetros cinéticos de las enzimas CYP humana recombinante y se encontró que CYP3A4 así como CYP1A2 y 2E1 estaban involucrados en la hidroxilación clorzoxazona, dependiendo de los contenidos de estas formas del CYP en los hígados. CYP2A6 recombinante y 2B6 y CYP2D6 tenían funciones importantes para el 7-O y etoxicumarina - deethylation chlorzoxazona 6-hidroxilación (V / m K relación max), respectivamente; sin embargo, estas formas del CYP tenían papeles relativamente menores en las reacciones, probablemente debido a la baja expresión en hígados humanos. Estos resultados apoyan la opinión de que las funciones de las enzimas CYP individuales en la oxidación de los productos químicos xenobióticos en microsomas de hígado humano se podían predecir por los parámetros cinéticos de las enzimas CYP individuales y por los niveles de cada uno de los enzimas CYP en microsomas de hígado de muestras humanas. Múltiples formas de citocromo P-450 (CYP) 2 existen en microsomas de hígado y estas formas CYP juegan un papel importante en la oxidación de estructuralmente diversos xenobióticos como las drogas, productos químicos tóxicos y cancerígenos, así como productos químicos endobiotic, incluyendo esteroides, ácidos grasos , vitaminas liposolubles y prostaglandinas (González, 1990; Guengerich y Shimada, 1991). Las principales enzimas CYP en hígados humanos identificados hasta la fecha incluyen CYP1A2, 2A6, 2B6, 2C8, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1, 3A4, 3A5 y (y 3A7 en el hígado fetal) (Shimada et al 1994;. Guengerich, 1995). CYP1A1 y 1B1 son las enzimas importantes que se expresan principalmente en los tejidos extrahepáticos; estas dos formas se han demostrado para oxidar diversos procarcinógenos y algunos de los productos químicos endobiotic (Kawajiri y Fujii-Kuriyama, 1991;. Hayes et al 1996; Shimada et al 1996a.). Existen grandes variaciones interindividuales en los niveles de cada una de estas enzimas CYP, y estas variaciones se consideran como uno de los principales factores que contribuyen a diferentes susceptibilidades de los seres humanos hacia acciones y efectos tóxicos de los fármacos, sustancias químicas tóxicas, y carcinógenos (Shimada et al. 1994 ; Guengerich, 1995). Varios estudios han informado de que dos o más enzimas CYP son capaces de oxidar xenobióticos y productos químicos endobiotic en la misma posición de las moléculas con diferentes afinidades (es decir, V max / K relación m) en microsomas de hígado humano (Wrighton et al, 1995;. Rendic y DiCarlo, 1997). Por ejemplo, 5-hidroxilación de omeprazol se ha demostrado que ser catalizada por la CYP2C19 y CYP3A4 (Andersson et al 1993;. Chiba et al 1993;. Yamazaki et al 1997a.); activación metabólica de acetaminofeno por CYP2E1 y 1A2 (Raucy et al 1989;.. Patten et al 1993; Snawger et al., 1994); O - deethylation de 7-etoxicumarina por CYP2E1, 1A1, 1A2 y (Yamazaki et al., 1996); 6-hidroxilación de chlorzoxazona por CYP2E1, 1A1, 1A2 y (Carriere et al 1993;. Ono et al., 1995); 5-hidroxilación de lansoprazol por el CYP3A4 y 2C19 (Pichard y otros, 1995;. Pearce et al., 1996); oxidación de la antipirina por el CYP1A2, 2C9 y 3A4 (Sharer y Wrighton, 1996; Engel et al., 1996); 1'-hidroxilación de bufuralol por CYP2D6, 1A1, 1A2 y (Yamazaki et al., 1994); 4-hidroxilación de tamoxifeno por CYP2D6, 2C9 y 3A4 (Wiseman y Lewis, 1996;. Crewe et al 1997); y 3-hidroxilación y N desmetilación de diazepam por CYP2B6, 2C19 y 3A4 (Ono et al 1996;. Yang et al., 1998). Las funciones de estas enzimas CYP en las reacciones de oxidación xenobióticos han demostrado ser determinado por la relación de V max a K m de formas CYP individuales y por los niveles de expresión de formas CYP individuales en microsomas de hígado de muestras humanas (Crespi y Penman , 1997; Iwatsubo et al 1997a;. Ito et al 1998).. Recientemente hemos demostrado que el omeprazol actividades 5-hidroxilación de diferentes muestras humanas se podían predecir con parámetros cinéticos de enzimas recombinantes y los niveles de CYP2C19 microsomal de hígado y 3A4 enzimas (Yamazaki et al., 1997a). En este estudio, hemos examinado aún más las funciones de las formas individuales de las enzimas CYP en el - deethylation O de 7-etoxicumarina y 6-hidroxilación de chlorzoxazona, dos reacciones modelo sugerido para ser catalizada por varias enzimas CYP (Carriere et al 1993;. Ono et al 1995;. Yamazaki et al 1996;. Yang et al 1999) en microsomas de hígado humano.. Los parámetros cinéticos para estas dos reacciones se determinaron en 14 formas de CYP humana recombinante expresadas en microsomas de células de NI Trichoplusia infectadas con un baculovirus que contiene CYP y NADPH-CYP reductasa insertos de ADNc humanos. Los papeles de varias enzimas CYP en microsomas de hígado se predijo con estos parámetros cinéticos de las enzimas CYP recombinantes y estima contenido de proteínas CYP en microsomas hepáticos de diferentes muestras humanas (Iwatsubo et al, 1997a, b;. Yamazaki et al., 1997a). Materiales y métodos Productos químicos. 7-etoxicumarina se obtuvo de Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI) y 7-hidroxicumarina de Katayama Chemical Co. (Osaka, Japón). Clorzoxazona y su metabolito 6-hidroxilado fueron donadas por el Dr. F. P. Guengerich de la Universidad de Vanderbilt. Otros reactivos y productos químicos utilizados en este estudio se obtuvieron de fuentes como se ha descrito anteriormente, o que de las más altas calidades disponibles comercialmente (Shimada et al. 1994. 1998). Preparación de la enzima. muestras de hígado humano se obtuvieron de donantes de órganos o pacientes sometidos a resección hepática como se describió previamente (Mimura et al 1993;. Shimada et al., 1994). microsomas de hígado se prepararon como se describe y se suspendieron en tampón 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) que contiene EDTA 1,0 mM y glicerol al 20% (v / v) (Guengerich, 1994). CYP1A1 recombinante, 1A2, 1B1, 2A6, 2B6, 2C8, 2C9, 2C18, 2C19, 2D6, 2E1, 3A4, 3A5 y 4A11 expresa en microsomas de células T. ni infectadas con un baculovirus que contienen CYP humano y cDNA reductasa NADPH-CYP insertos se obtuvieron de Gentest Co. (Woburn, MA); Se han usado los contenidos de CYP en estos sistemas como se describe en las hojas de datos facilitadas por el fabricante. Los ensayos enzimáticos. 7-etoxicumarina O actividades - deethylation por las enzimas CYP se determinaron por HPLC como se describe (Yamazaki et al. 1999). Brevemente, las mezclas de incubación consistía en microsomas de hígado humano (0,025 mg de proteína / ml) o CYP recombinante (5 pmol / ml) con varias concentraciones de 7-etoxicumarina en un volumen final de 0,20 ml de 100 de tampón de fosfato de potasio mM (pH 7,4) que contiene un sistema generador de NADPH (Shimada et al. 1996b). Las incubaciones se llevaron a cabo a 37 ° C durante 10 min y se terminó por la adición de 10 l de 60% HClO 4 (w / v). La formación de producto se analizó por HPLC con un C18-5 micras columna analítica (Mightsil RP-18, 150 x 4,6 mm; Kanto Chemical Co. Tokio, Japón) equipado con una columna de seguridad 5-m C18 (Mightsil RP-18, 5 4,6 mm; Kanto Chemical Co.). El eluyente consistió en una mezcla de 45% de CH3CN (v / v) que contiene 20 mM NaClO 4 (pH 2,5) y la detección fluorimétrica se realizó a una longitud de onda de excitación de 338 nm y una longitud de onda de emisión de 458 nm. Las mezclas de incubación (volumen final de 0,20 ml) para chlorzoxazone 6-hidroxilación fueron los mismos que para el ensayo de 7-etoxicumarina O - deethylation, excepto que el sustrato fue reemplazado por chlorzoxazone. Las reacciones se llevaron a cabo a 37 ° C durante 10 min y se terminó por la adición de una mezcla de 1,5 ml de CH 2 Cl 2 y 25 l de 43% H 3 PO 4. La capa orgánica, después de recoger por centrifugación, se evaporó a sequedad bajo atmósfera de nitrógeno y los materiales se disolvieron en 200 l de 27% CH 3 CN que contienen 0,5% H 3 PO 4. La formación de producto se determinó por HPLC con una columna de 4,6 mm × 150 Nucleosil octylsilyl (C 8) en fase inversa (Chemco Scientific, Osaka, Japón). contenido CYP se estimaron espectralmente por el método original (Omura y Sato, 1964). El contenido de proteínas CYP humanos en microsomas de hígado se estimaron por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida / desarrollo acoplado inmunoquímica (Western Blot) (Guengerich et al. 1982). Los antisueros de conejo generados contra CYP1A2 humana purificada hígado, CYP2A6, CYP2C9, CYP2E1, CYP3A4 y se prepararon como se ha descrito previamente (Shimada et al 1994;. Yamazaki et al 1997b.). Para la detección de CYP2B6 y CYP2D1, anti-WB-2B6 se utilizaron conejos (Gentest Co.) y la rata CYP2D1 (un regalo del doctor Y. Funae, Escuela de Medicina de la Universidad de Osaka, Japón). Las intensidades de las inmunotransferencias se midieron con un escáner Epson GT-8000 equipado con / Programa de Análisis de Gel NIH Image adaptado para ordenadores Macintosh. Las concentraciones de proteínas se estimaron por el método de Lowry et al. (1951). Análisis estadístico. Los parámetros cinéticos para 7-etoxicumarina - deethylation O y clorzoxazona 6-hidroxilación por las enzimas CYP humanos se estimaron con un programa de ordenador (KaleidaGraph; Synergy Software, Reading, PA) diseñado para el análisis de regresión no lineal. Predicción de la 7-O etoxicumarina - Deethylation y Clorzoxazona 6-hidroxilación por microsomas de hígado humano en base a parámetros cinéticos de las enzimas CYP recombinante. Para definir la posible función de las formas individuales de las enzimas CYP en la oxidación de 7-etoxicumarina y chlorzoxazona por diferentes muestras humanas, se calcularon las actividades previstas de microsomas de hígado 7-O etoxicumarina - deethylation humana y chlorzoxazona Actividades 6-hidroxilación con parámetros cinéticos de enzimas CYP humana recombinante y el contenido estimado de estas proteínas CYP por inmunotransferencia. La ecuación utilizada para la predicción de actividades que se espera se obtuvo a partir del método anterior (Iwatsubo et al 1997b.): Ecuación 1 donde v = predijo actividades de 7-etoxicumarina O - deethylation o clorzoxazona 6-hidroxilación (nanomoles de producto formado por minuto por miligramo de proteína); A, B, C, y D = contenido de las formas individuales de CYP (nanomoles por miligramo de proteína); S = concentración de sustrato; y K m1, 2, 3, y 4 y V max1, 2, 3, y 4 = parámetros cinéticos de las formas individuales (A, B, C, y D) de CYP, respectivamente. resultados Análisis cinético de 7-O etoxicumarina - Deethylation y Clorzoxazona 6-hidroxilación por 14 Formas de APP recombinante humana. Los parámetros cinéticos para 7-O y etoxicumarina - deethylation chlorzoxazona 6-hidroxilación por 14 formas de enzimas CYP humanas recombinantes (en microsomas de células de T. ni) se determinaron como se describe en Materiales y Métodos (Tabla 1). Discusión Los presentes resultados mostraron que las actividades de O - deethylation 7-etoxicumarina de microsomas de hígado humano se podría predecir con parámetros cinéticos de la enzima CYP1A2 recombinante, 2E1, 2A6, 2B6 y y contenidos de estas formas CYP en microsomas hepáticos humanos. CYP1A2 y 2E1 se sugirieron ser las principales enzimas implicadas en la O - deethylation de 7-etoxicumarina en hígados humanos. Las contribuciones de estas dos formas CYP fueron, sin embargo, encontraron que depender de los contenidos de formas CYP en el hígado de las muestras examinadas humanos. Cuando se utilizó una muestra humana C-12 que contenía niveles muy altos de CYP2E1 en el hígado, la actividad de 7-etoxicumarina O - deethylation dependía en gran medida de CYP2E1 (Fig. 2 D). Los resultados son de interés debido a la relación de V max a K m era ~ 2,5 veces mayor en CYP1A2 recombinante que el de CYP2E1 (Tabla 1). Ha sido ampliamente aceptado que el aclaramiento intrínseco se puede determinar por la relación de V max a K m de enzimas CYP en las reacciones de oxidación xenobióticos (Lin y Lu, 1997; Ito et al 1998;. Northrop, 1998). Los presentes resultados apoyan la idea de que los niveles de expresión de las formas individuales de CYP son también muy importantes en la comprensión de la base de aclaramiento intrínseco de oxidaciones xenobióticos por APP. Sin embargo, cuando se utilizó una muestra humana C-16 en la que los niveles de CYP1A2 y 2E1 expresión se determinó que eran 16 y 5% de CYP totales en microsomas de hígado, CYP1A2 contribuyó más evidentemente de CYP2E1 (Fig. 2 C). En una cuenta preliminar, se encontró que antihumano CYP1A2 IgG inhibe microsomal hepática 7-etoxicumarina O - deethylation (a una concentración de sustrato de 100 mM) con más fuerza que CYP2E1 anti-humano hizo en una muestra humana C-16, mientras que el anti-CYP2E1 IgG inhibe la actividad de una muestra de C-12 humana por ~ 80%. Los papeles de menor importancia de CYP2A6 y 2B6 en el 7-etoxicumarina O - deethylation se sugiere en este estudio, debido probablemente a las expresiones de bajo nivel de estas APP en microsomas hepáticos humanos, excepto que se sugirió que CYP2B6 ser en parte involucrada en la O - desetilación de 7-etoxicumarina en la muestra C-13 humana en la que el contenido de CYP2B6 fue relativamente alto (~ 9% de CYP total) en microsomas de hígado (Tabla 1). Anteriormente, se informó de que los niveles de CYP2B6 en microsomas hepáticos humanos son Stresser y Kupfer, 1999). Clorzoxazona se sugirió que se oxida principalmente por el CYP1A2, 2E1 y 3A4 en los microsomas de hígado humano. El valor V máximo de CYP2E1 recombinante para chlorzoxazona 6-hidroxilación fue la más alta de las 14 formas de CYP; sin embargo, el valor de Km de CYP2E1 era de 38 y 7 veces más altos que los de CYP1A2 y 3A4, respectivamente. Como resultado, la relación m / K V max de CYP2E1 para el 6-hidroxilación de la clorzoxazona era ~3.6 veces menor que el de CYP1A2. Sin embargo, los presentes resultados mostraron que el CYP2E1 fue el más activo en la catálisis de actividades Clorzoxazona 6-hidroxilación en la muestra C-12 humana en la que el nivel de expresión de CYP2E1 fue la más alta en muestras humanas examinados (Fig. 4 A). En las muestras de C-13 y C-16, se sugirió que CYP1A2, 2E1 y 3A4 están todos involucrados en la oxidación de clorzoxazona, dependiendo de las concentraciones de estos niveles de CYP en microsomas hepáticos. También es interesante observar que CYP1A2 era más activo en la catálisis de la clorzoxazona de CYP2E1 a bajas concentraciones de sustrato en una muestra de C-16, probablemente porque esta enzima tiene un componente de baja K m en microsomas de hígado humano, como se ha informado previamente (Yamazaki et al. 1996. 1999). Previamente se ha demostrado que CYP2E1 es una enzima importante en la catálisis de la clorzoxazona 6-hidroxilación en microsomas de hígado humano in vitro (Peter et al 1990;. Yamazaki et al 1995;. Kim et al., 1996), e in vivo cuando el fármaco es dosificado para los humanos (O'Shea et al 1994;. Williams et al 1994;. Vesell et al 1995;. Chen y Yang, 1996;. Kim et al 1996). Recientemente se ha informado y CYP3A4 (Gorski et al., 1997) en la reacción; papeles de otras enzimas CYP, como CYP1A2 (Ono et al 1995 Berthou et al., 1995).. Nuestros resultados actuales apoyan la opinión de que CYP1A2 y 3A4, así como CYP2E1 realmente involucrados en la oxidación de chlorzoxazona, en gran medida, dependiendo del contenido de estas enzimas CYP en microsomas de hígado de muestras humanas. Se encontró CYP1A1 ser muy activo en la catálisis de O - deethylation de 7-etoxicumarina y 6-hidroxilación de la clorzoxazona en enzimas recombinantes (insectos). CYP1B1 también se demostró para catalizar 7-etoxicumarina O - deethylation aunque no fue tan activo en la catálisis de la clorzoxazona. Estas dos formas de CYP se han demostrado que se expresa en los tejidos extrahepáticos en los seres humanos (Kawajiri y Fujii-Kuriyama, 1991; Shimada et al 1992. 1996b.), Y por lo tanto puede ser importante cuando el aclaramiento in vivo de varios productos químicos xenobióticos en que se considera. CYP3A4 se ha demostrado que es más abundante presente en microsomas de hígado humano; ~ 30% del total de CYP se sugiere a ser enzimas relacionadas CYP3A4 en microsomas hepáticos humanos de adultos (Shimada et al., 1994). Los estudios también han sugerido que Rendic y DiCarlo, 1997). La importancia de CYP3A4 en el chlorzoxazone 6-hidroxilación También se sugiere en este estudio, cuando se utilizaron muestras humanas con alto contenido de CYP3A4 en el hígado. Varios enfoques se han aplicado a predecir las microsomales de hígado humano actividades xenobiótico-oxidantes con parámetros cinéticos de las enzimas CYP recombinantes in vitro (Crespi, 1995; Crespi y Penman, 1997; Iwatsubo et al 1997a;. Rodrigues, 1999). Crespi y sus colaboradores han utilizado los denominados factores de actividad relativos (RAFS) para la predicción de las actividades de hígado humano; la RAF se puede calcular a partir de la relación de las actividades entre los microsomas de hígado humano y enzimas CYP recombinantes hacia sustratos específicos (conocidos) para las enzimas CYP individuales (Crespi, 1995; Crespi y Penman, 1997). Ellos mostraron que las contribuciones relativas de las enzimas CYP en las actividades de xenobióticos-oxidante por microsomas hepáticos humanos se pueden calcular mediante el uso de estos valores de la RAF de las formas individuales de CYP humana recombinante (Crespi, 1995; Crespi y Penman, 1997). Nuestro enfoque actual que fue propuesto originalmente por Iwatsubo et al. (1997a, b) se basa en la predicción con parámetros cinéticos de las enzimas CYP recombinantes y contenido de formas CYP individuales en microsomas de hígado humano. En ambos enfoques es muy importante saber si las enzimas CYP recombinantes en varios sistemas basados en cDNA tienen actividades catalíticas similares y especificidades de sustrato a las enzimas CYP nativas presentes en microsomas de hígado humano. También debe mencionarse que los niveles de expresión de la reductasa de NADPH-CYP en los sistemas de CYP recombinantes expresadas en células de T. ni son siempre más altos que los presentes en microsomas de hígado humano; la relación molar de la reductasa de CYP1A2 y 2E1 era 1,2 y 0,6 (de la hoja de datos proporcionado por el fabricante), respectivamente, mientras que en los microsomas de hígado humano la relación de la reductasa de CYP total fue ~0.05 (Kim et al. 1996) . En conclusión, los presentes resultados apoyan la opinión de que el aclaramiento intrínseco (V max / m relación K) de formas CYP individuales en la oxidación de los productos químicos xenobióticos es uno de los factores importantes para predecir las funciones de las formas individuales de CYP en microsomas hepáticos humanos . Sin embargo, los niveles de expresión de las enzimas CYP en microsomas hepáticos de diferentes muestras humanas son también muy importante en la comprensión de la base de roles de las formas individuales de CYP en las reacciones de oxidación xenobióticos. Reconocimiento Agradecemos al Dr. F. P. Guengerich para proporcionar chlorzoxazona y su metabolito 6-hidroxilado usado en este estudio.
